Un reactivo de protección Fmoc: Fmoc-Amox

La mayor parte de la síntesis de péptidos se logra mediante síntesis de péptidos en fase sólida utilizando métodos de protección Fmoc o Boc; sin embargo, cuando se usa Fmoc-OSu, debido a la formación de impurezas de dipéptido (o tripéptido) y β-alaninamida, en el aminoácido se puede introducir desprotegido. N en Fmoc parece ser un desafío. Aquí presentamos un método eficiente para la síntesis de Fmoc-Gly-OH basado en el derivado de oxima Fmoc-Amox sin reacciones secundarias. Fmoc-Amox es económico y Amox se puede eliminar fácilmente después de la reacción, proporcionando así Fmoc-Gly-OH puro sin impurezas ni contaminantes dañinos (principalmente dipéptidos o el propio Amox), que se puede obtener mediante cromatografía en fase líquida de alta eficiencia y Se demostraron RMN.

En 1963, Merrifield describió un nuevo concepto de síntesis química. Los ingredientes activos (API) de algunos medicamentos en el mercado son TIDES (agentes terapéuticos de oligonucleótidos y péptidos), que contienen entre 30 y 40 monómeros. Los cuerpos se produjeron utilizando un método en fase sólida descrito por primera vez por Merrifield. Aunque el método de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) fue inicialmente cuestionado hasta cierto punto por sus colegas europeos, ahora se utiliza ampliamente en la investigación y producción sintética.

Como puede verse en la nomenclatura, todos los aminoácidos tienen al menos dos grupos funcionales: un ácido carboxílico y un grupo amino. Si la actividad del ácido carboxílico C-terminal del aminoácido está cubierta por un grupo polimérico insoluble, el grupo amino se protege temporalmente y luego participa en la reacción paso a paso y de forma continua, incluida la eliminación del grupo protector del grupo amino. y luego acoplarse con el siguiente pareado de aminoácidos protegidos con N. Sin embargo, en el caso de aminoácidos trifuncionales, las cadenas laterales están protegidas por grupos protectores permanentes (o semipermanentes). En los primeros años, Merrifield usó bencilo (Bn) para protección a largo plazo y butoxicarbonilo inicial (Boc) como grupo de protección temporal, pero tanto Boc como Bn se pueden descomponer en condiciones ácidas: ácido trifluoroacético (TFA) de-Boc , Los ácidos fuertes como el HF o el ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA) hidrolizan el Bn. En la década de 1970, Carpino, quien también propuso el grupo protector Boc, revolucionó el campo de la química de péptidos al proponer el fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como grupo para proteger temporalmente el grupo amino, es decir, el grupo protector N puede eliminarse con una base. Por tanto, es ortogonal al grupo Boc. Además, Sheppard y Atherton en Europa, junto con Chang y Meienhofer en Estados Unidos, desarrollaron el método Fmoc/t-Bu al mismo tiempo y la reacción se trató con una solución de TFA para liberar el péptido. La implementación de este método marca la "civilización" de síntesis de péptidos, porque el uso del método Boc/Bn requiere químicos capacitados y equipo especial, mientras que a través del método Fmoc/t-Bu, otros laboratorios biológicos también pueden sintetizar péptidos. Además, este método ha permitido la producción de péptidos a escala de kilogramos.

Los primeros aminoácidos Fmoc comerciales se sintetizaron mediante el método Schotten-Baumann: el aminoácido se hizo reaccionar con Fmoc-Cl en condiciones básicas (Fig. 1A). A principios de la década de 1980, el grupo Ashish y Bachem y Goodman señalaron que la mayoría de los aminoácidos Fmoc comerciales contienen dipéptidos y tripéptidos. Estas impurezas provienen de la alta reactividad del Fmoc-Cl, que también puede reaccionar con el grupo carboxilo del aminoácido a proteger. Anhídrido, que a su vez puede reaccionar con el extremo amina de otra molécula de aminoácido, dando como resultado la formación de un dipéptido. El mecanismo se muestra en la Figura 1B.

Figura 1 Protección Fmoc de los aminoácidos
A. Mecanismo de protección del FMOC
B. Mecanismo de formación de dipéptidos protegidos durante la protección de aminoácidos

Teniendo en cuenta que incluso una pequeña proporción de impurezas puede provocar una pérdida de rendimiento y pureza, las partes concluyeron conjuntamente que se debe evitar el Fmoc-Cl. Debido a que estas reacciones secundarias están relacionadas con la masa del grupo saliente, el grupo de Ashish sugirió usar Fmoc-N3, también mencionado por Carpino y Han en su artículo. El grupo Ashish propuso sintetizar Fmoc-N3 con Fmoc-Cl y azida de sodio. Para evitar el peligro de la preparación y almacenamiento de Fmoc-N3, se utiliza ahora. El aminoácido Fmoc sintetizado mediante este método tiene una mayor pureza. Verlander et al. sugirieron el uso de Fmoc-OSU mediante la detección de diferentes grupos salientes, mientras que Bolin et al. sugirió el uso de reactivos sililantes para proteger el grupo carboxilo. Muchos años después, Barlos et al propusieron un método para preparar aminoácidos Trt a partir de Trt-Cl para evitar la formación de impurezas de éster de Trt. Posteriormente, Suresh et al. propusieron la preparación de Fmoc-aminoácidos a partir de Fmoc-Cl en presencia de polvo de zinc activado, lo que permitió condiciones neutras.

Sin embargo, durante mucho tiempo, el método más utilizado para la síntesis de aminoácidos Fmoc fue Fmoc-OSu (o NHS), que también fue cuestionado cuando Hlebowicz et al. La investigación de Bachem Europe muestra que Fmoc-AA-OH preparado usando Fmoc-OSu contiene Fmoc-β-Ala-OH y Fmoc-β-Ala-AA-OH, y estas dos impurezas pasan a través de Lossen después de que OSu ataca a un carbonilo. grupo. formado por reordenamiento (Figura 2).

Figura 2 El mecanismo de formación de β-alaninamida mediante el reordenamiento de Lossen

Estos hallazgos han revitalizado el entusiasmo de la investigación por el desarrollo de nuevos reactivos o métodos para la introducción segura de grupos Fmoc. La Tabla 1 enumera los diferentes derivados de Fmoc utilizados para proteger los aminoácidos y sus resultados para la preparación de Fmoc-Gly-OH. Aunque esta reacción puede usarse para la protección de todos los aminoácidos, Gly es más obvia debido a su bajo impedimento estérico. Propicio para la polimerización de alta eficiencia. Estos derivados introducidos por Fmoc deberían tener dos características clave: (i) ninguna reactividad especialmente alta, evitando la formación de oligopéptidos; (ii) el grupo saliente suele ser un compuesto hidroxilo sustituido por un aminoácido, que es relativamente estable durante el procesamiento. Más fácil de eliminar. Por lo tanto, el grupo Ashish propuso por primera vez Fmoc-2-mercaptobencimidazol, que sintetizó derivados de Fmoc con menos oligopéptidos (Tabla 1, n.º 4). Sin embargo, el subproducto 2-MBT liberado en la reacción tiene poca solubilidad y debe eliminarse por completo mediante lavado con disolventes orgánicos, mientras que los aminoácidos Fmoc también tienen cierta solubilidad en disolventes orgánicos, lo que no favorece el rendimiento final. Verlander et al. encontraron un problema similar: cuando se utilizan derivados de (poli)clorofenilo, los alcoholes disolventes orgánicos contaminan el producto final, lo que da como resultado rendimientos generales bajos (4-30%).

También se analizaron derivados de otras succinimidas, como ftalimida, norbornenilo (que es un radical libre derivado del norborneno), y los correspondientes análogos espiro, derivados de seis miembros, etc., pero no tuvieron una ventaja significativa (Tabla 1). , #5-7). Simultáneamente, se detectó la formación de β-alanina cuando se combinaron grupos norborneno con EDC para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) en agua. Para superar el problema de la intercalación de residuos de β-alaninamida causado por el uso de derivados de succinimida, Najera et al. propusieron un reactivo en forma de polímero y el contaminante de β-alaninamida final se inmovilizó sobre el soporte del polímero. Sin embargo, este método limita el uso para preparar pequeñas cantidades de aminoácidos protegidos.

Otras sustancias reactivas comúnmente utilizadas con compuestos de acoplamiento de carbodiimida como pentafluorofenilo (Pfp) o benzotriazol (Bt), aunque estos reactivos son relativamente caros (Pfp) o explosivos (Bt) (Tabla 1, #8, 9), pero los rendimientos son altos. , y algunos laboratorios incluso han investigado derivados de Fmoc-triazina (Tabla 1, #10) como una forma de sintetizar Fmoc-aminoácidos. Para el método de introducción de Fmoc usando una solución acuosa pura, se usó metilsulfato de Fmoc-fenildimetilsulfonio (Fmoc-ODsp), pero no se investigó la formación del dipéptido (Tabla 1, #11).

Para superar uno de los mayores desafíos en la síntesis de componentes básicos de péptidos, a saber, la formación no deseada de dipéptidos y tripéptidos durante la protección de los aminoácidos, se ha investigado intensamente el enfoque de una gran cantidad de grupos salientes Fmoc. Aunque un pequeño número de reactivos han dado resultados decentes, casi ninguno de ellos tiene potencial para ser utilizado en la producción industrial. En este sentido, basándose en la estructura de la oxima del aditivo de carbodiimida comúnmente utilizado, se propuso el derivado del grupo saliente Fmoc, Fmoc-Amox. Fmoc-Amox se ha utilizado para proteger H-Gly-OH, que es muy propenso a reacciones secundarias, con un alto rendimiento (93%), y no hay ningún subproducto en forma de Fmoc-dipéptido, que pueda Se puede ver en el análisis de HPLC y RMN. Confirmarse. Además, en el futuro se podrán utilizar derivados de Amox para introducir otros grupos protectores como pNZ, Alloc y Boc.

El grupo Ashish cree que Oxyma es un mejor aditivo que la carbodiimida. Oxyma tiene una fuerte reactividad y se utiliza cada vez más en la producción industrial de péptidos. El grupo también investigó otros derivados de oxima menos reactivos para introducir el grupo Fmoc, desde la primera selección (Tabla 1, #12-16), incluido el N-óxido de 2-hidroxipiridina (HOPO), derivado de Oxyma (Tabla 1, #12). dio un mayor contenido de dipéptido debido a su alta reactividad, seguido de HOPO (Tabla 1, #16). La cianopiridinio oxima también es un buen aditivo (Tabla 1, n.° 15), pero es costosa y difícil de eliminar de la reacción. La formación de dipéptidos en la segunda selección fue generalmente menor (Tabla 1, #17-20), por lo que se eligió el derivado de cianoamida (Amox) (Tabla 1, #20) como una alternativa a HOSu para introducir Fmoc. Fmoc-Amox es asequible y se puede eliminar fácilmente después de la reacción; a diferencia del caso de MBT, Amox tiene una solubilidad de 0,9 M en agua, lo que garantiza que no contamine el Fmoc-aminoácido final (Tabla 1, #4). .

En términos de formación de dipéptido Fmoc, H-Gly-OH demostró ser el mejor reactivo para evaluar el rendimiento de Fmoc-Amox debido a su bajo impedimento estérico que favorece una alta proporción de oligomerización. Usando 1 gramo y 40 gramos de dos experimentos paralelos para preparar Fmoc-Gly-OH, los resultados son similares, y el proceso de reacción se describe de la siguiente manera: la solución en acetona de Fmoc-Amox se agrega lentamente al H-Gly-OH y sodio agitados. Se añadió solución acuosa de carbonato, mediante separación continua, carbonato de sodio, por lotes para mantener el pH de la mezcla de reacción en 9-10. La reacción se controló mediante TLC así como la estabilidad del pH (una caída del pH como signo de reacción). Después de que se completó la reacción (4 horas), se eliminó el disolvente y la capa acuosa restante se lavó con DCM, seguido de la adición de HCl 1 N (hasta pH<2), dando como resultado un precipitado blanquecino, que luego se filtró. y se trató con acetato de etilo y n-hexano (93%). Después de la recristalización, la pureza de Fmoc-Gly-OH detectada por HPLC fue muy buena. Dado que el Fmoc-Gly-Gly-OH preparado mediante tecnología en fase sólida se eluirá junto con el Fmoc-Gly-OH, indica que la impureza del dipéptido formada es difícil de eliminar, como se muestra en la Figura 3, no se observa en el cromatograma. Trazas de dipéptidos (Figura 3). Además, la RMN 1H no mostró ninguna contaminación de Amox (Fig. 4), lo que muestra claramente que Amox tiene una gran ventaja en la síntesis de aminoácidos Fmoc.

Figura 3 (A) Cromatogramas de HPLC de Fmoc-Gly-OH y Fmoc-Gly-Gly-OH eluyendo juntos
(B) Cromatograma de HPLC de Fmoc-Gly-OH

Figura 4 Comparación de RMN de 1H y 13C de Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Amox y Amox

Motivados por estos resultados, se prepararon Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Val-OH (miniensayos de 10 g cada uno) utilizando el método descrito anteriormente (Figuras 5 y 6). La pureza del producto final se confirmó mediante HPLC y RMN, sin mostrar trazas de formación de dipéptido. También se investigó la importancia del disolvente durante el tratamiento. El producto resultante se disolvió en DCM y se extrajo usando agua destilada. El análisis de DCM ayudó a eliminar rastros de Amox, lo que dio como resultado un producto puro, según lo confirmado por RMN (Fig. 7).

Figura 5 (I) A. Cromatograma de HPLC de Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Phe-Phe-OH eluyendo juntos
B. Cromatograma de HPLC de Fmoc-Phe-OH
(II) Comparación de RMN 1H y 13C de Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Amox y Amox

Figura 6 (I) A. Cromatograma de HPLC de Fmoc-Val-OH y Fmoc-Val-Val-OH eluyendo juntos
B. Cromatograma de HPLC de Fmoc-Val-OH
(II) Comparación de RMN 1H y 13C de Fmoc-Val-OH, Fmoc-Amox y Amox

Figura 7 Comparación de los postratamientos de Fmoc-Phe-OH extraído con acetato de etilo y DCM

Estos resultados muestran claramente que Fmoc-Amox tiene grandes ventajas en la síntesis de aminoácidos Fmoc que son más propensos a reacciones secundarias.

Ejemplo de síntesis de Fmoc-aminoácidos:

1. Agregue glicina (131,34 mmol) y carbonato de sodio (106 mmol) al agua purificada y agregue gota a gota la solución de acetona Fmoc-Amox (119,4 mmol) para garantizar que el pH de la solución de reacción se mantenga siempre en 9-10. Después de que la TLC detectara que la reacción de Fmoc-Amox estaba completa, la solución de reacción se concentró para eliminar la acetona y luego se extrajo con diclorometano para eliminar las impurezas. La fase acuosa se acidificó con HCl 1 N y precipitó una gran cantidad de sólido blanco. Después de la filtración, la torta de filtración se lavó tres veces con agua purificada. El sólido recogido se recristalizó con acetato de etilo/n-hexano para obtener Fmoc-glicina de alta pureza.

2. Agregue fenilalanina o valina (33 mmol) y carbonato de sodio (75 mmol) al agua purificada y agregue gota a gota la solución de acetona Fmoc-Amox (30 mmol) para garantizar que el pH de la solución de reacción se mantenga siempre en 9-10. Después de que la TLC detectara que la reacción de Fmoc-Amox estaba completa, la solución de reacción se concentró para eliminar la acetona y luego se extrajo con diclorometano para eliminar las impurezas. La fase acuosa se acidificó con HCl 1 N y precipitó una gran cantidad de sólido blanco. Después de la filtración, la torta de filtración se lavó tres veces con agua purificada. El sólido recogido se recristalizó con acetato de etilo/n-hexano para obtener Fmoc-fenilalanina o Fmoc-valina de alta pureza.

Desde su creación en 2003, Suzhou Haofan Biological Co., Ltd. se ha centrado en la I+D y la producción de productos en el campo de agentes condensantes y agentes protectores formados por enlaces amida característicos. Dispone de una gama completa y de gran calidad. Los clientes pueden comprar. Para obtener más productos, visite el sitio web oficial de Haofan Biological.