Aplicación de reactivos biotinilados NHS-LC biotina y sulfo-NHS-LC biotina en un nuevo método de administración intravascular de fármacos

1. Información básica del compuesto

2. Investigación sobre la aplicación de un nuevo método de administración intravascular de fármacos

La biotina NHS-LC es un reactivo de biotinilación activado por éster NHS de cadena larga para el marcado de aminas primarias (como la proteína lisina) cuya permeabilidad de membrana lo hace útil para el marcado intracelular general. La biotina sulfo NHS-LC es soluble en agua y no escindible, y se puede utilizar como un reactivo de biotinilación simple y eficaz para anticuerpos, proteínas y cualquier otra macromolécula que contenga aminas primarias en solución. El marcado específico de proteínas de la superficie celular es otra aplicación común para estos reactivos únicos solubles en agua e impermeables a la membrana.

El equipo de Katsumi publicó "Un nuevo método de administración intravascular de fármacos que utiliza la biotinilación endotelial y el sistema avidina-biotina" en 2001. En este estudio, se desarrolló un nuevo sistema de administración intravascular de fármacos, que se inyectará desde el catéter. Para inmovilizar el fármaco en la vasculatura del tejido diana, la proteína celular de las células endoteliales vivas primero se biotinila directamente mediante un reactivo de biotinilación y luego se une mediante un fármaco de afinidad o un fármaco biotinilado utilizando avidina como conector.

En experimentos iniciales, se estudió in vitro la biotinilación de células endoteliales aórticas bovinas cultivadas (BAEC) mediante la aplicación de un reactivo de biotinilación (biotina NHS-LC o biotina sulfo-NHS-LC) sobre monocapas de BAEC intactas lavadas y se demostró que la cantidad de biotina unida a las células depende de la concentración de reactivo de biotina aplicado. Divida la concentración de biotina en el lisado celular por la concentración de proteína en el lisado (ng biotina/μg proteína) para normalizar el valor y tener en cuenta la posible pérdida de células durante el experimento. La Figura 1 muestra la relación entre la dosis de reactivo de biotinilación y la concentración de biotina corregida en los lisados ​​celulares. La concentración de biotina en los lisados ​​celulares aumentó con dosis crecientes de reactivos de biotinilación. Al comparar NHS-LC-biotina y sulfo-NHS-LC-biotina a la misma concentración, ligeramente más proteínas celulares fueron biotiniladas por NHS-LC-biotina. Por ejemplo, los lisados ​​celulares preparados a partir de 1,8 mM de biotina NHS-LC y biotina sulfo-NHS-LC tenían concentraciones de biotina de 0,390 y 0,304 ng por 1 g de proteína, respectivamente.

La biotina unida a las células disminuye con el tiempo después de la biotinilación, y la FITC-avidina está fácilmente disponible cuando se aplica a monocapas de BAEC biotiniladas. Combinar con células. El ensayo de liberación de LDH mostró que la biotina sulfo-NHS-LC fue solo ligeramente citotóxica para BAEC, y el ensayo de formación de colonias mostró solo efectos adversos leves de los reactivos. Se realizaron estudios in vivo en las arterias renales de conejos normales inyectando solución de biotina NHS-LC en un riñón a través de un catéter para biotinilar su vasculatura e inyectando el vehículo en el otro riñón como control, seguido de perfusión con solución salina. Finalmente, se inyectó una solución de FITC-avidina en ambos riñones, que se rechazaron con la sangre después de retirar el catéter. En las secciones histológicas, más del 85% de los glomérulos en los riñones biotinilados se tiñeron con fluoresceína, mientras que ninguno de los glomérulos en los controles se tiñó. En los riñones recolectados 2 días después de la misma cirugía, la mayoría de los glomérulos todavía estaban teñidos de manera brillante. La Figura 2 muestra que después de la biotinilación, la concentración de biotina en las CE disminuye con el tiempo. Cuando se utilizó biotina sulfo-NHS-LC, la concentración de proteína biotinilada disminuyó rápidamente con el tiempo, y solo quedó una pequeña cantidad después de 24 horas. Por otro lado, cuando se utilizó biotina NHS-LC, se detectó una gran cantidad de moléculas de biotina (60 %) en 24 horas y aproximadamente el 40 % todavía se detectó a las 48 horas. Las semividas de biotina calculadas a partir de los datos fueron 38,0 horas (biotina NHS-LC) y 10,8 horas (biotina sulfo-NHS LC), respectivamente.

Todas las BAEC se examinaron mediante microscopía de contraste de fases después de 24 horas de biotinilación como controles con 0,18-18 mM de biotina sulfo-NHS-LC y exposición al disolvente, y las células de todos los grupos fueron negativas y no mostraron ninguna anomalía morfológica. Por otro lado, como se muestra en la Figura 3, el grupo expuesto al reactivo de biotinilación 18 mM mostró un ligero aumento en los niveles de LDH en comparación con las dosis bajas (0, 0,18 y 1,8 mM) de biotinilación (prueba de Kruskal-Wo Liss, p < 0,02).

Para investigar si los inhibidores biotinilados alteran la viabilidad celular, se examinó su efecto sobre la proliferación celular mediante un ensayo de formación de colonias. Como se muestra en la Figura 4, la cantidad de colonias de BAEC disminuyó con el aumento de la concentración del reactivo. La inhibición de la formación de colonias fue evidente a 1,8-5,4 mM (prueba de Kruskal-Wallis, p<0,01).

En este experimento, también se investigó si los fármacos antibiotinilados podían inmovilizarse en células endoteliales biotiniladas viables. Los resultados se muestran en la Figura 5, la concentración de antiviral FITC en lisados ​​celulares aumentó con el aumento de la dosis inicial de antiviral FITC. El coeficiente de correlación entre la dosis inicial de FITC-avidina y su concentración en lisados ​​celulares fue de 0,987 (p = 0,012) cuando se utilizó NHS-LC-biotina y de 0,977 cuando se utilizó sulfo-NHS-LC-biotina (p = 0,026).

En el experimento final, se inyectó a los riñones biotinilados una solución antibiotina seguida de una solución de fluoresceína-biotina. Los riñones de control no habían sido biotinilados previamente, pero recibieron las mismas inyecciones de antibiotina y fluoresceína-biotina que las anteriores, y más del 80% de los glomérulos se tiñeron en los riñones biotinilados, pero no en los controles. Esto sugiere que los fármacos biotinilados pueden anclarse en la vasculatura biotinilada a través de la antibiotina sin ser arrastrados por la sangre. No se encontraron reacciones adversas obvias en la función de los riñones biotinilados, y este sistema de administración de fármacos es adecuado para el tratamiento de ciertas afecciones patológicas vasculares, como la proliferación microvascular en tumores malignos, y la administración continua de fármacos en ciertos órganos diana.

En este estudio, se investigó la biotinilación de células endoteliales vivas para desarrollar un método para administrar fármacos terapéuticos al área objetivo y anclar el fármaco a las células endoteliales vasculares en el área. Dos elementos clave de este estudio fueron el uso de cateterización para la administración de fármacos y el uso de derivados de biotina de ésteres NHS para la biotinilación. Los avances recientes en radiología intervencionista han hecho posible llegar a muchos lugares del cuerpo mediante cateterización vascular, y mediante la cateterización, administramos fármacos a células endoteliales vasculares en el riñón de conejo como órgano modelo. Varios investigadores han informado previamente sobre la biotinilación de células de tejido animal, como eritrocitos, linfocitos y células endoteliales, utilizando derivados de ésteres NHS de biotina para diversos fines. Los ésteres NHS son altamente reactivos con las proteínas, y los compuestos con ésteres NHS pueden inmovilizarse en células vivas mediante proteínas celulares. Fuente et al. Se ha informado del uso de pulmones aislados para biotinilar el endotelio pulmonar, seguido de la administración del reactivo biotinilado mediante inyección intravascular. El estudio del grupo de Katsumi es el primero en utilizar la biotinilación de células endoteliales vasculares con fines terapéuticos.